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Produktdesign von Proteinpräzipitaten mittels Seeding und kontrollierter Wachstumskinetik

IGF-Nr. 14965 N

Die Partikelbildung bei der Proteinfällung mit Hilfe von Impfpartikeln wurde untersucht und anhand dessen eine Strategie zur Optimierung der Produktqualität des Proteinpräzipitats entwickelt. Ein wesentlicher Kostenfaktor bei der Aufreinigung und Abtrennung von Proteinen liegt im Auffinden geeigneter Fällungs- und Kristallisationsbedingungen, die zu gewünschten Prozesszeiten und Produkteigenschaften führen. Eine Verkürzung der Prozesszeit und Verbesserung der Produktqualität ist durch das Verwenden von geeigneten Impfstrategien möglich. Dies wurde erstmalig systematisch für die Proteinfällung auch mit proteinfremden Impfstoffen untersucht und daraus Parameter abgeleitet, mit denen für weitere Proteine geeignete Impfstoffe ermittelt werden können.

Es wurde der Frage nachgegangen, welche bei der Fällung relevanten Protein- bzw. Prozessparameter welchen Einfluss auf die Beschaffenheit der gebildeten Niederschlagsphase ausüben. Ein Ausräumen der bestehenden Schwierigkeiten durch Abkehr von reiner Empirie und Hinwendung zu einer wissenschaftlich fundierten, auf systematischen Untersuchungen der relevanten Einflussgrößen basierenden Vorgehensweise vereinfacht die Optimierung der gesamten Aufarbeitungskaskade.

Die Zugabe von Impfpartikeln findet meist im metastabilen Gebiet statt. Deshalb wurde zunächst mit Hilfe von Trübungsmessungen und dem zweiten osmotischen Virialkoeffizienten geeignete Kristallisationsbedingungen (beeinflusst durch die Parameter pH-Wert, Temperatur, Fällungsmittelart und -konzentration) ermittelt. Die Trübungsmessungen zeigen ein schmales metastabiles Gebiet, weshalb man sich nicht auf dieses Gebiet beschränkt hat, sondern in einem weiten Übersättigungsbereich Kristallisationsexperimente mit Impfpartikeln durchgeführt hat.

Die Quantifizierung der Kristallisationskinetiken und der Präzipitateigenschaften in Abhängigkeit von der Übersättigung, den Lösungsbedingungen und den Eigenschaften der Impfpartikel (Art, Menge, Größe) war ein weiteres Ziel dieser Arbeit.

Diese Daten sind vor allem in industriellen Prozessen von großer Bedeutung, da sie Prozess- und Produkteigenschaften bestimmen und somit wesentlich zur Wirtschaftlichkeit des gesamten (Aufreinigungs-) Prozesses beitragen. Mit größerer Anfangsübersättigung wird die Übersättigung schneller abgebaut, mit im Allgemeinen größeren Partikelgrößen. Dies ist auf Aggregation der vielen gebildeten Keime zurückzuführen. Neben der homogenen Keimbildung, die schwer zu kontrollieren ist und zudem über die Übersättigung immer an das Kristallwachstum gekoppelt ist, wurde in einem zweiten Schritt der Einfluss von Impfkristallen untersucht. Dabei wurden Proteinkristalle in verschiedenen Größen und Mengen und auch Fremdstoffe wie Siliziumdioxid-Partikel, sowie mit Siliziumdioxid beschichtete magnetische Nanopartikel mit definierten Eigenschaften verwendet. Im Allgemeinen sinkt mit zunehmender Seedmenge die Prozesszeit. Bei kleinen Übersättigungen wird durch Zugabe von Impfkristallen Partikelbildung ermöglicht, in großen Übersättigungen unterdrückt die Impfkristallzugabe das Ausbilden einer amorphen Struktur und fördert die Bildung von größeren Aggregaten, was sich positiv auf eine nachfolgende Fest-Flüssig-Trennung auswirkt. Generell sind nach Animpfen der Experimente über weite Bereiche der Übersättigung die Produkteigenschaften sehr ähnlich, während im ungeimpften Fall die Übersättigung große Unterschiede in der Morphologie des Präzipitats verursacht. Auch mit den verwendeten Fremdstoffen, die als Kristallkeime fungieren, wachsen bei Übersättigung um die Fremdkeime Proteinkristalle mit der üblichen Kristallstruktur auf und es entstehen zum Teil größere Einkristalle.

Aufnahmen der Einkristalle mit dem konfokalen Mikroskop zeigen, dass in den Kristallen mehrere Seeds, die zum Teil während des Kristallisationsprozesses aggregiert sind, vorhanden sind. Die Proteinaktivität bleibt auch in Anwesenheit der Siliziumdioxidpartikel und magnetischen Nanopartikel erhalten. Eine weitere wichtige Eigenschaft neben der Konformation der Proteine ist die Festigkeit der Proteinkristallen, da sie maßgeblich die einzelnen Verfahrensschritte während der Herstellung beeinflusst. In Rührkesselexperimenten weisen die entstandenen Kristalle mit zunehmendem Energieeintrag geringere Partikelgrößen auf. Dies kann auf Abrieb und Bruch bzw. auf die Dispergierung von größeren Aggregaten zurückgeführt werden.

Der Präzipitationsprozess von Proteinen konnte erstmals in einem populationsdynamischen Modell in einem weiten Übersättigungsbereich abgebildet werden. Dazu wurden Keimbildung, Wachstum ebenso wie Aggregation berücksichtigt. Das Modell wurde mit zwei Parametern (Keimbildungskoeffizient und W-Faktor) an ein Experiment angepasst und konnte damit alle weiteren Experimente sehr gut nachbilden.

Auch die Simulation der Seeding-Experimente mit Proteinimpfkristallen lieferte gute Übereinstimmung mit den Messwerten, wobei bei kleiner Übersättigung zusätzliche Oberflächenkeimbildung berücksichtigt wurde. Dieses validierte Modell erlaubt Prozessstudien, die wichtige Erkenntnisse liefern und die Optimierung des Prozesses und der Produkteigenschaften auf die jeweils gewünschte Anwendung ermöglichen.

Forschungsstelle: Universität Erlangen-Nürnberg
Leiter des Projekts: Prof. W. Peukert
Laufzeit: 01.03.07.-31.07.09
Betreut durch Arbeitskreis 4

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BMWi-Logo Das IGF-Vorhaben Nr. 14965 N der Forschungsvereinigung Forschungs-Gesellschaft Verfahrens-Technik e.V., Theodor-Heuss-Allee 25, 60486 Frankfurt am Main wurde über die AiF im Rahmen des Programms zur Förderung der industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Energie aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages gefördert.

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